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AKAMATSU Y, MORISHITA S, CHIKUMI H, ET AL.

Evaluation of antigen-positive toxin-negative enzyme immunoassay results for the diagnosis of toxigenic Clostridium difficile infection

J Med Invest 2018;65(1.2):131-5

INTRODUZIONE

La diarrea associata a Clostridium difficile (CDAD) è una patologia infettiva nosocomiale che pone sfide particolarmente difficili, sia a causa delle elevate mortalità e morbilità associate sia per le difficoltà diagnostiche, legate alla necessità di una diagnosi accurata e tempestiva, che permetta l'inizio di una terapia efficace e di misure di isolamento del paziente, per impedire la diffusione dell'infezione.

Diversi test di laboratorio sono attualmente disponibili per l'identificazione di C. difficile o delle sue tossine. Il gold standard diagnostico è considerato l'esame colturale con isolamento del batterio, esame che però richiede diversi giorni e non è quindi adatto per una diagnosi precoce nei pazienti con CDAD. Il C. Diff Quik Check Complete assay, un test immunoenzimatico (EIA) che combina l'identificazione della glutammato deidrogenasi (GDH) del C. difficile e delle tossine A e B, viene largamente usato negli ospedali per la sua semplicità, rapidità ed economicità. Vi è però una discrepanza nella sensibilità del test fra GDH-positività e positività per le tossine (91-100% verso 61,9-78,6%), il che può rendere difficili le decisioni cliniche nel caso di pazienti con un risultato GDH- positivo/tossina-negativo. Tale risultato potrebbe indicare infatti la presenza di C. difficile produttore di tossine oppure di C. difficile non tossinogeno o anche la mancata presenza del batterio.

In questo studio, sono stati valutati i casi GDH-positivi/tossina-negativi al C. Diff Quik Check Complete assay e confrontati con i risultati ottenuti eseguendo colture anaerobiche seguite dall'identificazione delle tossine.

METODI

Lo studio retrospettivo è stato condotto presso il Tottori University Hospital (Giappone Occidentale), includendo i campioni fecali liquidi o semi-solidi ottenuti da pazienti ospedalizzati e sottoposti al test del C. difficile fra aprile 2012 e marzo 2017 (esclusi i campioni da pazienti ospedalizzati da meno di 2 giorni).

Analisi dei campioni
Tutti i campioni sono stati analizzati utilizzando il C. Diff Quik Check Complete assay entro 24 ore dal ricevimento, seguendo le istruzione del produttore. I campioni negativi per GDH non venivano ulteriormente studiati, mentre i campioni GDH-positivi e tossina-negativi erano successivamente analizzati utilizzando colture anaerobiche in agar cicloserina-cefoxitina-mannitolo seguite dalla valutazione della produzione di tossine da parte delle colonie di C. difficile isolate (tramite C. Diff Quik Check Complete assay).

Raccolta dei dati
I pazienti con test EIA GDH-positivo/tossina-negativo sono stati classificati come positivi per C. difficile tossinogenico e negativi per C. difficile tossinogenico sulla base dei risultati dell'esame colturale seguito dalla conferma della produzione di tossina specifica.

Le storie cliniche dei pazienti di entrambi i gruppi sono state raccolte dalle cartelle cliniche, includendo:

  • le caratteristiche demografiche (età, sesso);
  • le condizioni cliniche (indice di massa corporea [BMI], stato nutrizionale secondo lo score CONUT, durata dell'ospedalizzazione, esposizione ad antibiotici, trattamenti medici prima della diagnosi di CDAD);
  • i risultati delle analisi di laboratorio (globuli bianchi totali, emoglobina, albumina, urea, creatinina, eGFR).

Analisi statistica
Per determinare la relazione fra le storie cliniche e la presenza di C. difficile tossinogenico nei pazienti con un risultato GDH-positivo/tossina-negativo al C. Diff Quik Check Complete assay, i due gruppi di pazienti sono stati confrontati utilizzando analisi univariate (Student's t-test, Mann- Whitney U test e test del chi-quadrato) e multivariate (analisi di regressione logistica multipla).

RISULTATI

Durante il periodo in studio, un totale di 2675 campioni di feci è stato sottomesso per il test del C. difficile utilizzando il C. Diff Quik Check Complete assay, ottenendo i seguenti risultati:

  • 234 (8,8%) erano GDH-positivi/tossina-positivi (GDH+/tossina+);
  • 356 (13,3%) erano GDH-positivi/tossina-negativi (GDH+/tossina–);
  • 2085 (77,9%) erano GDH-negativi/tossina-negativi (GDH–/tossina–).

Dei 356 campioni GDH+/tossina–, 136 sono stati esclusi dall'analisi (poiché non rispettavano di criteri di eleggibilità dello studio), mentre i rimanenti 220 sono stati ulteriormente analizzati con esame colturale e conferma della produzione di tossina:

  • C. difficile tossinogenico è stato identificato in 139 (63,2%) campioni;
  • C. difficile non tossinogenico è stato identificato in 60 (27,3%) campioni;
  • C. difficile non è stato identificato in 21 (9,6%) campioni.

Il valore predittivo positivo (PPV) per la presenza di CDAD del risultato GDH+/tossina– del test era pari al 63,2%.

Sono state quindi confrontate le storie cliniche dei pazienti positivi (139 pazienti) e negativi (81 pazienti) per C. difficile tossinogenico. Le caratteristiche demografiche non differivano significativamente fra i due gruppi, ma i pazienti con C. difficile tossinogenico presentavano un BMI significativamente più basso rispetto ai pazienti negativi (19,5±0,4 verso 20,9±0,5, p = 0,02).

All'analisi multivariata per l'identificazione dei fattori di rischio per la presenza di C. difficile tossinogenico nei pazienti con risultato GDH+/tossina– al C. Diff Quik Check Complete assay, solo un più basso BMI è risultato un fattore significativo per l'identificazione del C. difficile tossinogenico in questo gruppo di pazienti (OR: 0,894; IC 95% 0,828-0,966; p = 0,01). Il numero di globuli bianchi e il valore di eGFR, identificati come fattori di rischio all'analisi univariata, non erano significativi in multivariata.

DISCUSSIONE

In questo studio, sono stati analizzati i risultati del C. Diff Quik Check Complete assay in un singolo ospedale per un periodo di 5 anni, mostrando che il 13,3% della popolazione analizzata aveva un risultato GDH+/tossina–. Fra questi, il 63,2% dei campioni era positivo per C. difficile tossinogenico sulla base dei risultati del test colturale con ricerca della tossina di conferma. Questi dati suggeriscono che vi è un vasto numero di pazienti positivi alla ricerca del GDH e negativi per la tossina al test EIA che sono probabilmente pazienti con vera CDAD.

Il PPV per l'identificazione del C. difficile tossinogenico tramite C. Diff Quik Check Complete assay nei pazienti con risultati GDH+/tossina– osservato in questa analisi (63,2%) è relativamente alto rispetto al range riportato in studi precedenti (21,7-94,7%). Una possibile spiegazione risiede nel fatto che la maggior parte dei campioni del presente studio è stato ottenuto esclusivamente da pazienti con alta probabilità di CDAD (feci liquide o semi-solide durante terapia antibiotica).

I dati qui riportati forniscono un'evidenza teorica per l'inizio di misure di isolamento e di una terapia specifica nei pazienti con risultati GDH+/tossina–, in attesa dei risultati del test colturale di conferma. Queste misure, tuttavia, sono costose e impegnative per la struttura sanitaria, ragione per la quale sarebbero auspicabili analisi simili in ogni ospedale.

Fra i fattori di rischio per CDAD, un basso BMI è stato identificato come l'unico fattore predittivo indipendente nei pazienti GDH+/tossina–, un'associazione che potrebbe essere mediata da fattori che influenzano il microbioma o da un'alterata funzionalità del sistema immunitario nei pazienti con basso BMI. Al contrario, i fattori di rischio comunemente descritti in studi precedenti (incluso l'uso precedente di antibiotici) non sono stati identificati in questa analisi. È possibile che questa discrepanza dipenda dalle specifiche caratteristiche del sottogruppo di pazienti esaminato.

CONCLUSIONI

Una proporzione significativa dei pazienti con risultato GDH-positivo/tossina-negativo usando il C. Diff Quik Check Complete assay risulta infettata con C. difficile tossinogenico, tali pazienti sono quindi considerati veri casi di CDAD. Questo è il risultato che si ottiene se i campioni da analizzare vengono prelevati da pazienti adeguati, come quelli con feci liquide o semi-solide dopo terapia antibiotica. L'analisi di questi pazienti in ogni ospedale fornisce la base teorica per l'implementazione di strategie di isolamento e di trattamento per questi individui. Un basso BMI costituisce un fattore di rischio addizionale che può essere utilizzato per identificare i casi con vera CDAD in questa popolazione. Questi dati saranno utili per l'adozione di strategie pragmatiche per la gestione di questi pazienti in attesa che i risultati dei test di conferma siano disponibili in ogni ospedale.

 

COMMENTO

a cura di Daniela Pasero
Terapia Intensiva Cardiochirurgica, SC Anestesia e Rianimazione 1U; Dipartimento di Anestesia e Rianimazione; AOU Città della Salute e della Scienza, Torino.

Il Clostridium difficile rappresenta una delle cause più complesse da gestire nell'ambito delle infezioni nosocomiali associate all'assistenza, a causa della difficoltà nell'ottenere una diagnosi accurata in tempi brevi, al fine di trattare solo i pazienti infetti il più rapidamente possibile e soprattutto consentire un adeguato isolamento sia degli infetti sia dei colonizzati, per evitarne la diffusione.

In questo studio retrospettivo di Akamatsu et al. emerge un problema tuttora aperto, ovvero che nonostante la disponibilità di diversi test di laboratorio per l'identificazione del Clostridium e delle sue tossine, il gold standard rimane la coltura con l'isolamento del batterio, che però può richiedere diversi giorni per avere una risposta, con un conseguente ritardo nell'inizio della terapia e dell'isolamento del paziente affetto da diarrea associata a Clostridium difficile (CDAD). Tra i vari test disponibili, gli autori prendono in esame un test immunoenzimatico (EIA) che consente un rapido riconoscimento attraverso l'identificazione dell'antigene del glutammato deidrogenasi (GDH) e delle tossine A/B del Clostridium, il C. Diff Quick Check Complete assay (C. Diff Check-60; TechLab, Blacksburg, VA, USA) [1]. Questo test, raccomandato dalla Società Americana di Malattie Infettive (IDSA 2010) e dalla Società di Epidemiologia Americana (SHEA) [2], è largamente usato perché semplice, rapido e poco costoso, ed è altamente affidabile per l'identificazione del GDH, benché poco sensibile per l'identificazione delle tossine. Pertanto, in caso di GDH positivo e tossina negativo, il solo test EIA non è sufficiente.

Gli autori di questo studio hanno cercato di correlare i dati clinici dei pazienti presi in esame con i dati di laboratorio utilizzando sia il test EIA sia il test colturale. Di tutti i campioni esaminati, 356 (circa il 13%) erano GDH-positivi e tossina-negativi. Di questi, sono stati selezionati per criteri di eleggibilità 220 campioni, su cui è stato eseguito anche l'esame colturale. Di questi, 139 (63,2%) sono risultati produttori di tossina, a conferma di quanto già riportato in letteratura [3]. Tra le caratteristiche demografiche e cliniche dei pazienti presi in esame, l'unico dato significativo all'analisi multivariata è risultato il valore di BMI (OR: 0,894; IC 95% 0,828-0,966; p = 0,01). Sembra che un basso BMI possa aumentare il rischio del paziente di sviluppare una malattia da Clostridium (CDAD).

In un recente studio di Ohshima et al. sui fattori di rischio correlati a infezione da Clostridium difficile (CDI) emerge come siano significativi una prolungata ospedalizzazione (oltre 50 giorni), l'utilizzo degli inibitori di pompa protonica (PPI) e l'aumento dei globuli bianchi (>10.000/µl), sia per i pazienti che erano risultati positivi al test EIA per la produzione di tossina (TP), sia per quelli tossina-negativi, che però erano produttori di tossina al test colturale [4]. Tra i pazienti con TP al test EIA, l'OR (IC 95%) era 2,16 (1,24-3,75) per i globuli bianchi elevati e 9,03 (4,9-16,6) per l'utilizzo di PPI. Pertanto, tra i predittori più forti in caso di test EIA con tossina positiva risultavano i PPI, ma anche antibiotici come i carbapenemi, le cefalosporine e i fluorochinoloni.

In conclusione, la conoscenza di fattori di rischio associati allo sviluppo di CDI o CDAD può essere utile per individuare quali, tra i pazienti che presentano un test EIA positivo ma con tossina negativa, siano, con alta probabilità, dei veri CDAD (ovvero positivi anche al test colturale) e quindi che debbano essere isolati e sottoposti a trattamento prima della risposta dell'esame colturale. È importante comunque anche la selezione dei pazienti a cui eseguire il test EIA, ovvero solo quelli con feci liquide o semi-solide e con forti fattori di rischio legati all'assistenza, in modo da evitare test immunoenzimatici inutili e soprattutto terapie in eccesso nei casi dubbi in cui si debba attendere l'esame colturale.

BIBLIOGRAFIA

  1. Sharp SE, Ruden LO, Pohl JC, et al. Evaluation of the C.Diff Quik Chek Complete Assay, a new glutamate dehydrogenase and A/B toxin combination lateral flow assay for use in rapid, simple diagnosis of clostridium difficile disease. J Clin Microbiol 2010;48:2082-6.
  2. Cohen SH, Gerding DN, Johnson S, et al. Clinical practice guidelines for Clostridium difficile infection in adults: 2010 update by the Society for Healthcare Epidemiology of America (SHEA) and the Infectious Diseases Society of America (IDSA). Infect Control Hosp Epidemiol 2010;31:431-55.
  3. Yoo IY, Song DJ, Huh HJ, Lee NY. Simultaneous detection of Clostridioides difficile glutamate dehydrogenase and toxin A/B: comparison of the C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE and RIDASCREEN Assays. Ann Lab Med 2019;39:214-7.
  4. Ohshima T, Osaki T, Yamamoto Y, Asai S, Miyachi H, Kamiya S. Evaluation of risk factors for Clostridium difficile infection based on immunochromatography testing and toxigenic culture assay. J Clin Microbiol 2018;56(12). pii: e00555-18.

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