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GHEBREMEDHIN B, HALSTENBACH A, SMILJANIC M, ET AL.

MALDI-TOF MS based carbapenemase detection from culture isolates and from positive blood culture vials

Ann Clin Microbiol Antimicrob 2016;15:5

INTRODUZIONE

La resistenza batterica agli antibiotici è in aumento negli ultimi decenni. L’identificazione degli specifici meccanismi di resistenza è di estrema importanza per i microbiologi clinici per la diagnosi e il trattamento delle infezioni sistemiche, poiché permette un trattamento efficace di queste infezioni e la de-escalation da una terapia ad ampio spettro all’uso di antibiotici mirati. Sono quindi necessari test diagnostici rapidi per fornire informazioni immediate su cui basare le misure terapeutiche e il controllo dell’infezione.
Questo studio è stato condotto al fine di validare l’efficacia di un test di spettrometria di massa (MS) MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight) nell’identificazione dei batteri Gram-negativi carbapenemasi-produttori in terreni di coltura solidi e campioni di emocoltura.

METODI

Il test è stato validato su 63 isolati di batteri Gram-negativi carbapenemasi-produttori (incluse Enterobacteriaceae e batteri non fermentanti), tutti precedentemente caratterizzati a livello molecolare per il tipo di enzima prodotto, e 35 specie di Gram-negativi carbapenemi-resistenti non produttori di carbapenemasi, come controllo negativo. 
L’identificazione delle specie batteriche è stata condotta utilizzando un sistema MALDI-TOF Biotyper (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) e il test di suscettibilità antimicrobica fenotipica utilizzando un sistema automatico Phoenix™ (Becton-Dickinson, Heidelberg, Germany).
Dopo 4 ore di incubazione in presenza di imipenem 0,1 mM, i campioni da terreni di coltura solidi e da emocolture positive sono stati analizzati tramite spettrometria di massa MALDI-TOF. 

Criteri di identificazione

  • L’assenza del picco imipenem/matrice a 479 m/z (299 + 180 m/z) è stato considerato positivo per la produzione di carbapenemasi.
  • Per gli isolati non carbapenemasi-produttori, il picco imipenem/matrice è stato registrato a 479 m/z.

RISULTATI

Identificazione dei picchi rilevanti dopo idrolisi
Dopo ottimizzazione del test di idrolisi con definizione del tempo di incubazione (4 ore), l’analisi MALDI-TOF è stata condotta prima dell’idrolisi (controllo negativo) e i risultati paragonati a quelli ottenuti dopo incubazione. Il segnale MS del complesso matrice-imipenem scompariva nei campioni di isolati produttori di carbapenemasi. Per le specie non produttrici, il picco era osservato a 479 m/z.

Analisi di ceppi di Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e differenti Enterobacteriaceae isolati direttamente da terreni di coltura solidi

Sono stati analizzati:

  • 38 isolati di A. baumannii, tutti positivi geneticamente per la presenza di carbapenemasi (29 portatori delle varianti del gene OXA);
  • 25 isolati di P. aeruginosa ed Enterobacteriaceae positivi geneticamente per la presenza di carbapenemasi (7 produttori delle varianti del gene OXA);
  • 35 controlli resistenti a imipenem e meropenem ma negativi per la presenza di geni codificanti per la carbapenemasi.

Il test ha rivelato una specificità del 100% (nessuno dei controlli mostrava attività idrolitica alla spettrometria di massa) e una sensibilità del 97,4% (n = 37/38) per la presenza di idrolisi negli isolati di A. baumannii e del 100% per i diversi isolati di Enterobacteriaceae e P. aeruginosa da coltura solida.

Analisi di ceppi di Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e differenti Enterobacteriaceae isolati direttamente da campioni liquidi di emocolture positive
Al fine di ottenere risultati più rapidi, il test di idrolisi è stato condotto anche su campioni di emocolture positive:

  • 38 isolati di A. baumannii;
  • 25 isolati di P. aeruginosa ed Enterobacteriaceae;
  • 35 controlli resistenti a imipenem e meropenem ma negativi per la presenza di geni codificanti per la carbapenemasi.

Il test ha rivelato una specificità del 100% e una sensibilità del 63,2% (n = 24/38) per la presenza di idrolisi negli isolati di A. baumannii e del 96% per i diversi isolati di Enterobacteriaceae e P. aeruginosa (24/25) da emocolture positive.

DISCUSSIONE

Diversi studi hanno valutato l’utilità della MS MALDI-TOF per l’identificazione degli antibiotici beta-lattamici e dei prodotti di degradazione da parte delle beta-lattamasi entro le 4 ore, sia da terreni di coltura sia da campioni positivi di emocoltura. I test di idrolisi possono solo identificare la presenza di beta-lattamasi come meccanismo di resistenza, mentre l’identificazione delle proteine effettivamente conferenti resistenza nei ceppi batterici isolati tramite MALDI-TOF sembra essere più difficile, poiché i quadri proteici dei batteri sono molto complessi. 

In questo studio, il complesso imipenem-matrice è stato identificato a 479 m/z e la matrice è stata dimostrata a 180 m/z. Nei casi di isolati produttori di carbapenemasi, il picco di questo complesso era scomparso, ma né i prodotti di degradazione né le varianti sodiche dell’anticorpo erano evidenziabili. Il test di idrolisi utilizzato era basato solo sulla scomparsa del picco imipenem-matrice per considerare un isolato come produttore di carbapenemasi, a differenza di altri studi che hanno preso in considerazione la scomparsa del picco di imipenem o un rapporto imipenem intero/idrolizzato <0,5. Inoltre, in 14 casi di A. baumannii isolati direttamente da emocolture non è stato possibile dimostrare l’attività della carbapenemasi, nonostante incubazioni e analisi ripetute.

In conclusione, il test di spettrometria di massa MALDI-TOF descritto è in grado di identificare i batteri produttori di carbapenemasi da terreni di coltura solidi (98-100%) o da campioni di emocoltura (96%) entro 4 ore per tutti gli isolati non-A. baumannii. Nei casi di isolati di A. baumannii, il test è molto sensibile per l’identificazione di carbapenemasi direttamente dai terreni di coltura solidi.

 

COMMENTO FINALE

A cura di Francesco G. De Rosa
Prof. Associato, Malattie Infettive, Vice-Direttore, Dipartimento di Scienze Mediche, Università di Torino, Ospedale Amedeo di Savoia, Corso Svizzera 164, 10149 Torino

Siamo all’inizio di una nuova era di diagnostica microbiologica rapida delle infezioni batteriche e fungine, in un contesto clinico di sempre maggiore complessità dei pazienti internistici, chirurgici e immunocompromessi di vario tipo. Inoltre, i budget ospedalieri sono frequentemente soggetti a variazioni durante l’anno, rendendo spesso difficili studi farmacoeconomici in grado di illustrare il valore positivo del reale ammortamento delle spese su un periodo di medio e lungo termine.

In questo campo, l’attività dell’infettivologo va intesa a trecentosessanta gradi, dalla prevenzione al controllo delle infezioni, dalla diagnostica alla terapia fino alla de-escalation, al corretto follow-up e alla riduzione delle recidive. Le metodiche microbiologiche rapide includono metodi colturali, tra cui il MALDI-TOF, e metodiche non colturali, come l’identificazione di materiale genomico da campioni di vario tipo. Probabilmente, tali metodiche accompagneranno ancora le consuete indagini colturali sui batteri, che a oggi consentono di avere un dato “fenotipico” di sensibilità alla terapia somministrata.

Molteplici sono le domande alle quali il medico, il microbiologo e l’amministratore devono rispondere: quando usare le metodiche di diagnostica rapida? Per quanto tempo tali metodiche dovranno ancora essere accompagnate da quelle tradizionali? Come faremo ad avere sempre dati di sensibilità delle popolazioni batteriche identificate come agenti etiologici? Il loro impiego sarà permesso in termini di allocazione delle risorse?

L’articolo allegato di Ghebremedhin e coll. illustra l’utilità del MALDI-TOF per il rilevamento delle carbapenemasi su terreno solido o liquido, prodotte da K. pneumoniae e P. aeruginosa, mentre per A. baumannii è risultato più utile il terreno solido. Il risultato, disponibile 4 ore dopo la positività del colturale, ha una sensibilità da terreno solido di circa il 98-100% e di circa il 96% da terreno liquido. In pratica, si tratta di inserire imipenem nella coltura positiva, da mezzo solido o liquido, e verificare, dopo gli opportuni step illustrati nei materiali e metodi, l’assenza del picco corrispondente alla componente imipenem/matrice a 479 m/z, indicativa di produzione di carbapenemasi.

L’epidemia contemporanea di infezioni da batteri multiresistenti, includendo le diverse carbapenemasi di K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii,costringe a implementare tutte le attività sopra citate: prevenzione, controllo delle infezioni, diagnostica, terapia, de-escalation. Sappiamo quanto sia importante la terapia antibiotica empirica appropriata o quanto sia pericoloso il ritardo terapeutico, soprattutto quando siamo di fronte a pazienti fragili, internistici, chirurgici e immunocompromessi. Negli ospedali laddove K. pneumoniae produttrice di carbapenemasi è endemica, i quadri clinici delle infezioni nosocomiali opportunistiche non sono di univoca attribuzione etiologica e possono essere sovrapponibili, ad esempio, a quelli causati da tutti i batteri Gram-negativi ma anche da Candida e da C. difficile.

La domanda finale è quindi quale potrebbe essere l’esatta collocazione di questo test basato sul MALDI-TOF, che nell’articolo in oggetto è stato valutato solo su emocolture positive? Si può affermare, in epoca di razionalizzazione delle risorse, che tale test possa essere di ausilio per la corretta scelta della terapia antimicrobica empirica in pazienti gravi, instabili, recentemente trasferiti da altro nosocomio, senza colonizzazione gastroenterica nota per batteri che producono carbapenemasi, oppure con recente candidemia o infezione da C. difficile laddove K. pneumoniae è endemica, nel contesto delle sindromi enteropatogenetiche opportunistiche [1]; ma anche in pazienti critici intensivistici, colonizzati o meno da germi MDR [2]; oppure nei pazienti immunocompromessi di vario tipo, anche trapiantati, con infezioni gravi, in attesa di conferma etiologica definitiva. Ponendo la domanda in un programma di antimicrobial stewardship, la risposta andrà verosimilmente verso una individualizzazione delle risorse, creando un apposito algoritmo diagnostico-clinico che consenta di avere il miglior rapporto costo-beneficio.

 

BIBLIOGRAFIA

  1. De Rosa FG, Corcione S, Raviolo S, et al. Candidemia, and infections by Clostridium difficile and carbapenemase-producing Enterobacteriaceae: new enteropathogenetic opportunistic syndromes? Infez Med 2015;23(2):105-16.
  2. Bassetti M, De Waele JJ, Eggimann P, et al. Preventive and therapeutic strategies in critically ill patients with highly resistant bacteria. Intensive Care Med 2015;41(5):776-95.
 

a cura della redazione di Editamed Srl
AINF-1194516-0000-ZER-W-08/2018
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