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IOANNOU P, ANDRIANAKI A, AKOUMIANAKI T, ET AL.

Albumin enhances caspofungin activity against Aspergillus species by facilitating drug delivery to germinating hyphae

Antimicrob Agents Chemother 2015;60:1226-33

SINTESI

Le echinocandine, una classe di agenti antifungini con azione sulla sintesi della parete cellulare, sebbene caratterizzate da una potente attività in vivo contro le specie di Candida e Aspergillus, non sono in grado di inibire la crescita di Aspergillusin vitro, pur inducendo un esteso danno alle ife germinative. Per questa ragione la loro attività in vitro viene misurata tramite determinazione della MEC (minimum effective concentration).
Fra le ragioni di questa discrepanza, sono stati proposti (e in parte documentati) meccanismi di immunomodulazione in grado di spiegare l’aumentata efficacia di questi agenti verso Aspergillus spp. in vivo. In aggiunta, il microambiente tissutale al sito di infezione potrebbe anche influenzare l’attività antifungina delle echinocandine.
In questo studio, viene dimostrato che, a differenza di tutti gli altri agenti antifungini disponibili, incluse le altre echinocandine, caspofungina mostra un importante aumento di attività contro diverse specie di Aspergillo dipendente dal mezzo di coltura cellulare e mediato dall’albumina.

METODI

I test di suscettibilità antifungina su isolati clinici di Aspergillus (raccolti da pazienti con aspergillosi invasiva) sono stati condotti utilizzando metodi di microdiluizione: le sospensioni di conidi sono state diluite nel medium di coltura RPMI adeguato e seminate a concentrazioni finali comprese fra 0,4 e 5 x 104/ml, in presenza di diluizioni seriali di antifungino (voriconazolo, anidulafungina, amfotericina B, caspofungina e micafungina).
I test di suscettibilità sono stati eseguiti:

  1. in medium standard (RPMI con MOPS) con crescita in aria ambientale e
  2. sotto condizioni di coltura cellulare, utilizzando un medium contenente RPMI 1640 supplementato con 10% di siero fetale (FCS), 2 mM di L-glutamina e 10 mM di HEPES a pH 7,4, con crescita in un incubatore a CO2. In esperimenti successivi, sono stati modificati diversi parametri di coltura, inclusi la presenza di FCS e albumina e il tipo di buffer (MOPS invece di HEPES).

In aggiunta, sono stati condotti i seguenti test:

  • attività metabolica (XTT reduction assay);
  • test di vitalità (CFDA fluorimetric viability assay);
  • studi di fluorescenza (FITC-BSA e DDAO-caspofungina);
  • valutazione al microscopio elettronico a scansione (SEM).

RISULTATI

Le condizioni di coltura cellulare potenziano l’attività di caspofungina contro le specie di Aspergillus.
Sotto condizioni di coltura cellulare, l’attività di caspofungina (ma non degli altri antifungini testati) è risultata significativamente aumentata contro tutti gli isolati di Aspergillus, come evidenziato da una significativa riduzione della MEC (da 2 a 64 volte) (Tabella). In queste condizioni, anche l’attività metabolica (EC50s all’XTT assay) e il test di vitalità (CFDA fluorescenza) dei ceppi isolati sono stati significativamente ridotti da caspofungina rispetto ai risultati ottenuti in condizioni standard.

Tabella. Effetto delle condizioni di coltura cellulare sull’attività inibitoria di caspofungina e voriconazolo contro differenti specie di Aspergillus, sulla base dei valori di MIC (o MEC per caspofungina)

 CaspofunginaVoriconazolo
 MEC (ng/ml)MIC (ng/ml)
CeppoMOPSFCSMOPSFCS
A. fumigatus 293500125250250
A. fumigatus ATCC 46645500125250250
A. flavus isolato clinico 1500250500125
A. flavus isolato clinico 225012550063
A. terreus isolato clinico 1100016250125
A. terreus isolato clinico 150031500500

L’effetto di potenziamento è dipendente dal siero e mediato dall’albumina
Questo aumento di attività di caspofungina contro Aspergillus era indipendente dalla composizione del medium e dalla concentrazione di CO2, ma dipendeva dalla concentrazione di siero nel mezzo di coltura e dalla presenza di concentrazioni fisiologicamente rilevanti di albumina. Studi di microscopia elettronica a scansione hanno mostrato che, in presenza di albumina, concentrazioni di caspofungina inferiori alla MEC causavano un danno significativo alle ife di Aspergillus. L’albumina invece non aumentava l’attività delle altre due echinocandine testate, micafungina e anidulafungina.

L’albumina si lega alle ife germinative di Aspergillus e aumenta il legame di caspofungina
L’albumina marcata (FITC-albumina) ha mostrato un alto grado di associazione specifica con le ife germinative di Aspergillus (ma non con i conidi), effetto potenziato da un’esposizione a caspofungina per 18 ore.
Inoltre, l’aggiunta di albumina al mezzo di coltura aumentava significativamente (circa 4,5 volte) l’associazione di caspofungina fluorescente (DDAO-caspofungina) alle ife di Aspergillus, suggerendo un’azione dell’albumina nel facilitare il delivery del farmaco alle ife germinative.

DISCUSSIONE

In questo studio, è stato valutato se i fattori legati all’ospite e associati con il microambiente tissutale al sito di infezione potessero essere implicati nell’aumentata attività in vivo delle echinocandine contro Aspergillus, eseguendo i test di suscettibilità antifungina in condizioni di coltura cellulare che simulano diversi aspetti della crescita tissutale fisiologica. È stato trovato un aumento profondo e significativo dell’attività di caspofungina in queste condizioni, consistente in tutte le specie di Aspergillus esaminate e non osservato con le altre classi di agenti antifungini testati. Il ruolo svolto dai componenti del siero in questo effetto era stato indagato in studi precedenti, con risultati contrastanti. Va comunque sottolineato che, rispetto agli studi precedenti, gli autori di questo lavoro hanno utilizzato concentrazioni di siero più basse (10%), considerate fisiologicamente più rilevanti (l’interazione fra caspofungina e Aspergillus avviene nel polmone, dove le concentrazioni di siero sono basse). L’interazione positiva del siero con caspofungina negli esperimenti sopra riportati era mediato quasi esclusivamente dall’albumina, che appare agire come carrier e che non presenta la stessa attività nei riguardi delle altre echinocandine.
Nell’insieme, questi risultati illustrano un nuovo meccanismo di interazione sinergistica fra caspofungina e albumina contro Aspergillus, che potrebbe avere implicazioni fisiologiche e terapeutiche. La definizione dei parametri strutturali che permettono all’albumina di migliorare il delivery e potenziare l’azione anti-Aspergillus di caspofungina rispetto agli altri agenti antifungini potrebbe aprire la via al disegno di nuove molecole carrier in grado di aumentare il delivery di altri composti ai loro bersagli terapeutici. Infine, ulteriori studi su un maggior numero di ceppi di Aspergillus in differenti laboratori sono necessari per confermare che l’interazione sinergistica dell’albumina con caspofungina dovrebbe essere presa in considerazione negli studi di suscettibilità in vitro.

 

COMMENTO

a cura di Francesco G. De Rosa
Professore Associato, Malattie Infettive - Dipartimento di Scienze Mediche, Università di Torino

In generale, la differenziazione delle echinocandine consente di mettere in evidenza, nella terapia delle candidemie e delle candidosi invasive, piccole differenze che tuttavia possono avere un’importante ricaduta pratica, come ad esempio per la farmacocinetica e le interazioni farmacologiche. Nel caso dell’aspergillosi invasiva (AI) la differenziazione delle echinocandine ha un valore più relativo per l’attività fungistatica di classe e per il fatto che solo la caspofungina ha un’indicazione ufficiale in terapia di salvataggio.

L’articolo di Ioannou et al. prende in considerazione un aspetto microbiologico delle echinocandine in genere considerato marginale, ricordando anche una possibile attività immunomodulante di classe e un incremento dell’attività microbiologica contro Aspergillus in condizioni di ipossia tissutale. Infatti lo studio della sensibilità agli antifungini in un modello di coltura cellulare ha messo in evidenza un aumento caspofungina-specifico di attività anti-Aspergillus, dettagliando anche un’azione sinergica caspofungina-albumina a livello molecolare con concentrazione maggiore delle due molecole a livello delle ife di Aspergillo.

La ricaduta pratica di questi dati ottenuti in vitro può non essere immediata, in quanto l’utilizzo di caspofungina nel trattamento dell’AI non è in prima linea terapeutica. È importante però sottolineare ancora una volta quante informazioni siano ottenute da adeguati studi sul legame proteico e dalle interazioni con le proteine plasmatiche anche a livello tissutale e della sede di infezione: il legame proteico delle tre echinocandine è simile e quindi gli Autori suggeriscono in maniera appropriata un’interazione molecola-specifica. D’altra parte, l’attività delle echinocandine è già stata oggetto di studio per quanto riguarda fenomeni immunomodulatori, espressione di citochine e incremento dell’attività antifungina con ipossia tissutale.

Si possono fare considerazioni, in linea con quelle espresse dagli Autori o aggiuntive, anche ipotizzando che la maggiore attività di caspofungina in condizioni di coltura cellulare e in presenza di albumina non sia a oggi adeguatamente sfruttata nel parenchima polmonare dei pazienti immunocompromessi con AI. Ad esempio, sembra fisiologico chiedersi se i risultati nella terapia delle AI possano essere diversi con un dosaggio superiore di caspofungina.

 

AINF-1236472-0000-CAN-W-10/2019
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