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SANGUINETTI M., POSTERARO B.

MALDI-TOF Mass Spectrometry: Any Use for Aspergilli?

Mycopathologia. 2014 Jul 8

INTRODUZIONE

Gli sforzi per sviluppare metodi di laboratorio affidabili ed economici per la diagnosi delle malattie fungine come l'aspergillosi hanno avuto come esito la messa a punto di una nuova tecnologia di spettrometria di massa denominata MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight).
Per quanto riguarda gli aspergilli, la capacità della spettrometria di massa MALDI-TOF di fornire un profilo proteico di isolati cresciuti in coltura consente l'identificazione semplice e accurata di singole specie all'interno di differenti sezioni o complessi, distinguendo tra specie morfologicamente e filogeneticamente simili, mediante il confronto con spettri di specie fungine note e depositati in banche dati. Pertanto, il ricorso a tecniche di biologia molecolare più lunghe e onerose è ristretto a quei casi in cui nelle banche dati, al momento dell'analisi, non sono disponibili gli spettri fungini utili al confronto.
A riguardo, occorre sottolineare la necessità di fare riferimento a spettri ottenuti utilizzando procedure simili a quelle utilizzate nel proprio laboratorio, e di aggiornare costantemente queste banche dati con ceppi e specie non rappresentate, o non rappresentate sufficientemente bene, nella versione attuale.
Rispetto a quanto è stato fatto per l'identificazione delle muffe, sono limitati i lavori riguardanti la tipizzazione dei ceppi o i test di suscettibilità agli antifungini di Aspergilli condotti con la spettrometria di massa MALDI-TOF. Nel caso in cui venissero potenziate queste attività complementari della ricerca, la MALDI-TOF MS potrebbe efficacemente supportare i laboratori di microbiologia e micologia nel loro ruolo primario di assistenza agli specialisti del controllo delle infezioni o i medici nella diagnosi e nel trattamento dell'aspergillosi.

 

COMMENTO FINALE

A cura di Daniela Pasero
Terapia Intensiva Cardiochirurgica, SSCVD Anestesia in Cardiochirurgia, SC Anestesia e Rianimazione 1U; Dipartimento di Anestesia e Rianimazione; AOU Città della Salute e della Scienza, Corso Bramante 88/90 10126 Torino.

In questa review di Sanguinetti e Posteraro vengono discussi alcuni aspetti problematici della diagnostica in microbiologia, quali i costi elevati e i tempi lunghi, e la possibilità di ottenere una precisa valutazione routinaria di patologie fungine come l’aspergillosi attraverso affidabili metodi di laboratorio. La biologia molecolare ha consentito di ottenere risultati migliori in tempi più rapidi, ma non può essere utilizzata per la valutazione routinaria soprattutto in relazione ai costi. Recentemente la spettrometria di massa (MS) e nello specifico la matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight (MALDI-TOF) sembra rispondere a tutte le caratteristiche richieste da una metodica microbiologica efficiente, ovvero che consenta di ottenere risposte affidabili e con tempi rapidi. Il MALDI-TOF è una tecnica recentemente emersa con grande potenzialità nell’identificazione di microorganismi e, paragonata ai metodi tradizionali che spesso richiedono tempi lunghi d’incubazione, ha il vantaggio di identificare batteri e funghi direttamente da colonie cresciute su piastre di coltura in pochi minuti e con semplici procedure.
Molto importante è il ruolo che essa può avere ai fini della decisione terapeutica. Il genere dell’Aspergillus comprende un elevato numero di specie clinicamente rilevanti, la cui diagnosi risulta a volte complessa con le metodiche classiche di laboratorio. In particolare alcune forme definite criptiche perché morfologicamente indistinguibili sono individuabili solo attraverso la biologia molecolare. Dal punto di vista clinico, circa il 10% degli aspergilli isolati sui trapiantati con aspergillosi invasiva possono essere definiti criptici e molti di questi hanno un’elevata concentrazione minima inibente (MIC) in vitro agli antifungini, per cui è molto importante una corretta identificazione proprio al fine di una corretta decisione terapeutica.
Gli autori parlano di come la tecnica MALDI-TOF MS, definita come rivoluzionaria, sia oggi percepita come un passaggio fondamentale nella microbiologia clinica di routine. Descrivono i due strumenti attualmente disponibili in Europa per la diagnosi routinaria: MALDI Biotyper by Bruker Daltonics (Germania) e Vitek MS IVD system by Biomérieux (Francia). Il software del Biotyper, il più utilizzato, genera uno score che varia da 0 a 3, dove uno score >2 è sicuramente diagnostico in termini di identificazione di specie e genetica.
Sei studi hanno analizzato diversi sistemi di MALDI TOF per l’identificazione di specie fungine e in particolare di Aspergillus; tutti hanno utilizzato come metodica di riferimento la biologia molecolare, alcuni anche l’analisi morfologica. Tutti gli Autori, utilizzando sistemi diversi, hanno ottenuto una corretta identificazione (accuracy) con una percentuale variabile tra l’81,8 e il 100%, che attesta l’alta affidabilità della tecnica ai fini diagnostici, in tempi molto più rapidi rispetto alla diagnostica convenzionale.
Gli stessi Autori, nel loro studio condotto con l’utilizzo del metodo Biotyper per l’identificazione di diverse specie di aspergilli, parlano della difficoltà nel differenziare l’Asperigillus Flavus da A. Oryzae, molto simili morfologicamente, e della necessità di utilizzare metodiche di biologia molecolare molto complesse al fine di poterli distinguere. La necessità di differenziare le due specie sta nel fatto che A. Flavus produce delle aflatossine molto dannose che A. Oryzae non produce. Vi sono inoltre delle forme di A. Flavus che non producono aflatossine e che sono altamente correlate a A. Oryzae e questo supporterebbe l’ipotesi che una linea di A. Flavus atossigeno sia gradualmente evoluta verso una forma domestica di A Oryzae attraverso la selezione umana. In questo ambito è risultato molto utile il ruolo della MALDI-TOF MS nel differenziare forme tossigene da quelle atossigene in tempi molto più rapidi rispetto alla diagnostica convenzionale che in questo caso richiede anche un’analisi biomolecolare complessa e costosa.
Un promettente ambito di utilità futura della MALDI-TOF MS è nell’individuare eventuali profili di resistenza. Inoltre, l’analisi di campioni di Candida e Aspergillus esposti a diluizioni seriali di caspofungina consente di individuare ceppi con ridotta sensibilità alla caspofungina stessa e di conseguenza il mutante FKS in sole tre ore. Anche gli autori hanno sviluppato un sistema basato sul MALDI-TOF MS per testare la sensibilità delle specie fungine alle echinocandine (caspofungina). Le echinocadine esercitano il loro effetto antifungino inibendo in modo non competitivo la 1,3-glucano sintasi, un enzima utilizzato dalla parete cellulare di funghi come le Candide e gli Asperigilli. Il test da loro proposto ha una durata di circa 15 ore e prevede l’incubazione di cellule fungine con concentrazioni seriali di farmaco. L’analisi con il MALDI-TOF utilizza un approccio basato su un indice di correlazione composito (CCI). Questo permette di determinare la minimal profile change concentration (MPCC,) che è un’alternativa alla MIC o alla minima concentrazione efficace (MEC). Utilizzando un set di isolati di Candida e Aspergillus wild type e mutante FKS, viene dimostrata un’ottima concordanza tra MPCC e MIC nel 100% degli isolati.
Al di là dei riconosciuti benefici della MALDI-TOF, il costo delle apparecchiature rimane paragonabile agli altri comuni strumenti di laboratorio: infatti, malgrado il costo dell’esecuzione del test sia relativamente basso, la necessità di manutenzione frequente e la durata relativamente breve del laser ne riduce i vantaggi economici. Un altro aspetto critico è la continua necessità di aggiornamento dei database delle specie fungine. A parte questi aspetti negativi, la MALDI-TOF rappresenta un valido sistema per la micologia clinica sia per quanto riguarda la possibilità di effettuare test di suscettibilità a farmaci e individuare eventuali profili di resistenza molto precocemente sia per indagini epidemiologiche sulle specie fungine. Per quanto riguarda la sua utilità per l’individualizzazione dei profili di resistenza è necessario definire meglio la riproducibilità e la standardizzazione dei test di suscettibilità agli antifungini (AFST) basati sulla MALDI-TOF e eventualmente estenderla anche ad altri farmaci antifungini per poterlo utilizzare in futuro nei laboratori di microbiologia. È inoltre importante valutare se vi sia una correlazione tra i risultati straordinari di questa tecnica e i breakpoint clinici per l’Aspergillus, utilizzati per interpretare i valori di MIC che possano identificare profili di resistenza. In particolare, nel contesto delle infezioni da A. Fumigatus, dove è sempre più frequente la presenza di ceppi resistenti agli azoli anche a livello ambientale, questa tecnica potrebbe rivestire un ruolo importante nell’ottenere la diagnosi in tempo reale ai fini terapeutici.
In conclusione il MALDI-TOF rappresenta una tecnica promettente per la microbiologia clinica, che se correttamente implementata potrebbe ottimizzare tempi e costi di diagnosi di laboratorio, soprattutto nell’ambito delle infezioni fungine, dove spesso un ritardo diagnostico comporta una terapia inadeguata che incrementa inevitabilmente la morbilità e la mortalità. Infine la possibilità di condurre indagini epidemiologiche consente una più rapida individuazione di ceppi resistenti.

 

BIBLIOGRAFIA

  • De Carolis E, Vella A, Vaccaro L et al. Application of MALDI-TOF mass spectrotomy in clinical diagnostic microbiology. J Infect Dev Ctries 2014; 8(9):1081
  • Patel R. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in clinical microbiology. Clin Infect Dis 2013; 57:564–72
  • De Carolis E, Posteraro B, Lass-Floerl C et al. Species identification of Aspergillus,Fusarium and Mucorales with direct surface analysis bymatrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Microbiol Infect 2012; 18:475–84
  • De Carolis E, Vella A, Florio AR, et al. Use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for caspofungin susceptibility testing of Candida and Aspergillus species. J Clin Microbiol 2012; 50:2479-64
 

a cura della redazione di Springer Healthcare Italia Srl
AINF-1103561-0008-CAN-W-03/2017
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